Kelelahan kerja merupakan salah satu permasalahan kesehatan dan keselamatan kerja yang dapat menjadi faktor risiko terjadinya kecelakaan pada saat bekerja. Kelelahan pada pekerja dapat berdampak terhadap penurunan produksitivitas kerja dan penurunan konsentrasi kerja. Dari hasil pendahuluan dari 10 pekerja di Instalasi Farmasi Rumah Sakit Pusat Pertamina Jakarta diperoleh 7 pekerja mengalami kelelahan sedang. Permasalahan dalam penelitian ini adalah faktor-faktor yang berhubungan dengan kelelahan kerja pada karyawan di Rumah Sakit Pusat Pertamina Jakarta tahun 2016. Rancangan penelitian menggunakan pendekatan cross sectional. Bertujuan untuk melihat hubungan antara variabel dependen (kelelahan kerja) dengan variabel independen (jenis kelamin, usia, status perkawinan, riwayat penyakit, masa kerja, dan shift kerja). Teknik yang digunakan dalam pengambilan sampel adalah total sampling dengan jumlah responden 103 pekerja. Teknik pengambilan data kelelahan kerja menggunakan kuesioner 30 item gejala kelelahan umum IFRC (International Fatigue Research Committee of Japanese Association of Industrial Health). Uji statastik menggunakan uji chi-square. Hasil penelitian menunjukkan bahwa 59 karyawan mengalami kelelahan kerja tingkat sedang (57,3%). Hasil uji statistik pada beberapa faktor yang menjadi penyebab kelelahan kerja yaitu jenis kelamin (pvalue 0,025), usia (pvalue 0,026), status perkawinan (pvalue 0,000), status gizi (pvalue 0,267), masa kerja (pvalue 0,000) dan shift kerja (pvalue 0,437). Kesimpulan jenis kelamin, usia, status perkawinan dan masa kerja menunjukkan adanya hubungan yang bermakna dengan kelelahan kerja. Sedangkan status gizi dan shift kerja menunjukkan tidak ada hubungan bermaknaa dengan kelelahan kerja. Saran sebaiknya pembagian tugas antara laki-laki dan perempuan pada karyawan di Instalasi farmasi dengan penyesuaian kemampuan, kebolehan, keterampilan, serta keterbatasannya masing-masing.