Jamur tiram (Pleurotus ostreatus) mengandung serat lignoselulosa yang merupakan serat tidak larut air yang bersifat laksatif, menurunkan resiko kanker kolon, mengurangi asupan kalori dan mengontrol berat badan. Melalui produk mi yang menjadi makanan kegemaran masyarakat, jamur tiram yang dijadikan tepung menjadi bahan subtitusi pada pembuatan produk mi tinggi serat. Tujuan dari penelitian ini adalah memanfaatkan jamur tiram (Pleurotus ostreatus) sebagai bahan subtitusi mi untuk menghasilkan produk mi tinggi serat. Penelitian ini terdiri dari penelitian pendahuluan yaitu pembuatan tepung jamur tiram dan analisis karakteristik sifat kimianya, dan penelitian utama yaitu formulasi produk mi tinggi serat, formula terpilih berdasarkan uji hedonik akan diuji proksimat dan seratnya. Rancangan percobaan penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan taraf perlakuan 0%, 30%, 40% dan 50%. Data yang diperoleh dari uji organoleptik dianalisis menggunakan ANOVA dilanjut uji lanjut Ducan?s Multipe Test dengan tingkat kepercayaan 95%. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan tepung jamur tiram mempengaruhi mutu dan tingkat kesukaan panelis. Didapatkan ada perbedaan (p<0,05) pada tingkat kesukaan panelis secara keseluruhan. Hasil terbaik mi tinggi serat yaitu pada formulasi dengan penambahan tepung jamur tiram sebanyak 30%, dengan rata-rata skor nilai uji hedonik berdasarkan mutu (warna, aroma, rasa dan kekenyalan) mencapai 4,8 (netral, cenderung agak suka), dan sajian mi tinggi serat sebanyak 100 g memiliki kandungan energi 110 kkal, karbohidrat 18 g, protein 5 g, lemak 2 g, dan serat 7 g.