Telah dilakukan penelitian untuk mengetahui pengaruh pH dan penambahan metanol terhadap pertumbuhan khamir Pichia pastoris dan uji daya hambat antimikroba terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coll. Tujuan penelitian ini adalah : untuk mengetahui pengaruh pH dan penambahan metanol terhadap pertumbuhan khamir Pichia pastoris yang dapat dilihat dari kurva pertumbuhannya serta metabolit sekunder yang dihasilkannya apakah dapat menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus dan Escherichia coll. Penelitian ini dilakukan menggunakan 2 faktor yaitu : faktor pH (faktor A) dan faktor metanol (faktor B), faktor waktu. Dengan taraf faktor untuk faktor pH adalah 5, 6, 7 , taraf faktor untuk metanol adalah : dengan penambahan metanol dan tanpa penambahan metanol. Sampling setiap 4 jam sekali selama 48 jam. Data jumlah sel yang diperoleh dianalisa dengan menggunakan analisa variansi (Anova) dilanjutkan dengan uji Duncan dengan tingkat kepercayaan 95%. Hasil penelitian berdasarkan uji anova terdapat interaksi antara pH, metanol dan waktu. Berdasarkan uji Duncan bahwa pH 6 dengan penambahan metanol ternyata memiliki total rata-rata tertinggi yaitu : 3,48795 x 106 sel /ml, sedangkan pada pH7 tanpa penambahan metanol memiliki total rata-rata terendah yaitu : 2,5971 x 106 sel/ml. Sehingga urutan yang tertinggi sampai dengan urutan yang terendah yaitu : pH6 dengan metanol > pH 6 tanpa metanol > pH 5 dengan metanol > pH 5 tanpa metanol > pH 7 dengan metanol > pH 7 tanpa metanol. Berdasarkan uji daya hambat bahwa metabolit sekunder yang dihasilkan Pichia pastoris mempunyai daya hambat terhadap Staphylococcus aureus dan Escherichia coil hanya pada pH6 dengan penambahan metanol dan pH7 dengan penambahan metanol atau tanpa metanol.